Effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells on the epithelialization of rabbits' skin autograft (Oryctolagus cuniculus) / Efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães na epitelização de autoenxertos de pele em coelhos (Oryctolagus cuniculus)

The present study aimed to evaluate the effects of mesenchymal stem cells derived from canine adipose tissue in the healing process of full-thickness mesh skin grafts in rabbits. The stem cells were collected from young dogs; and, after characterization, remained in cryopreservation, in independent doses containing 2 x 106 cells. The mesh distal limb graft technique was performed in 60 rabbits, divided into three groups, CG (Control Group), GT1 (Intralesional Stem Cell Treated Group), and GT2 (Intravenous Stem Cell Treated Group), containing 20 animals each. After grafting, each group was randomly divided into four subgroups according to euthanasia time 3, 7, 14, and 30 days, containing five animals in each group. Animals of GT1_14, GT1_30, and GT2_14, GT2_30 subgroups received a second dose of xenogeneic cells on the seventh day. Meanwhile, animals from GT1_30 and GT2_30 received the third dose of xenogeneic cells on day 14. The groups treated with xenogeneic stem cells positively affected type III collagen re-epithelialization and deposition, and possibly GT1 had a controlled inflammatory response. However, no effect on angiogenesis. Thus, it was possible to demonstrate tolerance and therapeutic action of mesenchymal stem cells from canine adipose tissue in skin grafts in rabbits.(AU)

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães no processo de cicatrização de autoenxertos de pele de espessura total em malha em coelhos. As células-tronco foram coletadas de cães jovens, após a caracterização estas permaneceram em criopreservação, em doses individuais contendo 2 x 106 células. A técnica de enxerto em malha na região distal do membro foi realizada em 60 coelhos, divididos em três grupos, GC (Grupo Controle), GT1 (Grupo tratado com células-tronco intralesional) e GT2 (Grupo tratado com células-tronco via endovenosa), contendo 20 animais cada. Imediatamente após a enxertia, cada grupo foi dividido aleatoriamente em quatro subgrupos, de acordo com o tempo de eutanásia 3, 7, 14 e 30 dias contendo cinco animais cada. Animais dos subgrupos GT1_14, GT1_30 e GT2_14, GT2_30 receberam uma segunda dose de células xenógenas no sétimo dia. Ademais, animais do GT1_30 e do GT2_30 receberam a terceira dose de células xenógenas no dia 14. Os grupos tratados com células-tronco xenógenas tiveram um efeito positivo na reepitelização e deposição de colágeno tipo III, e possivelmente, o GT1 teve uma resposta inflamatória controlada, entretanto o efeito na angiogênese não foi observado. Dessa forma, foi possível demonstrar que houve tolerância e ação terapêutica das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães em enxertos de pele em coelhos.(AU)

Mastocitoma cutâneo canino: estudo retrospectivo dos casos atendidos pelo Serviço de Oncologia do Hospital Veterinário da FCAV-Unesp, Campus Jaboticabal, de 2005 a 2015 / Canine cutaneous mast cell tumors: retrospective study of cases attended by the oncology service at the Veterinary Hospital of FCAV-Unesp, Jaboticabal, from 2005 to 2015

Este estudo teve como objetivo analisar os casos de mastocitomas cutâneos em cães atendidos no Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) Unesp Câmpus Jaboticabal, no período de 2005 a 2015, além de avaliar a ocorrência dessa neoplasia em relação à raça, sexo e idade; determinar as regiões corpóreas mais acometidas e as características neoplásicas observadas, assim como, os métodos de diagnóstico mais utilizados no setor, estabelecer os principais graus histológicos diagnosticados e os tratamentos preconizados, verificar alterações de tamanho em relação aos linfonodos, à taxa de recidiva, metástase e possíveis associações entre as variáveis consideradas. Foram avaliados 192 prontuários clínicos de pacientes e observou-se que os cães sem raça definida (SRD) (n=46, 23,96%) foram os mais acometidos, seguidos por cães da raça Boxer (n=40, 20,83%) e Pit bull (n=27, 14,06%). A maioria dos cães eram fêmeas (n=107, 55,7%), e com idade de 7 a 11 anos (n=120, 62,5%). Do total, 32 pacientes apresentaram (16,7%) tumores localizados em membro pélvico, seguidos por nódulos em membro torácico (10,4%, n=20). Sessenta e cinco animais possuíam nódulos ulcerados (33,9%), sendo 96 nódulos de consistência firme (50%). Setenta e seis animais apresentavam múltiplos nódulos (39,6%) e aqueles acima de três centímetros perfaziam 39,1% da amostra (n=75). O método mais utilizado para o diagnóstico foi a punção aspirativa por agulha fina associado à histopatologia (HT), totalizando 39,8% dos nódulos (n=66), seguido pela HT com 37,3% (n=62). Em relação às variáveis histológicas, 18 pacientes apresentaram grau I (11,8%), 112 com grau II (73,7%) e 22 com grau III (14,5%) de acordo com Patnaik et al. (1984). Segundo a classificação de Kiupel et al. (2011), 37 casos foram classificados como de alto grau (35,2%) e 68 como sendo de baixo grau (64,8%). Foi observada associação estatística quando se avaliou a presença de nódulos solitários/múltiplos e o grau histológico, segundo Patnaik et al. (1984) (p=0,008) e Kiupel et al. (2011) (p=0,004), sendo que nódulos com piores características prognósticas eram mais frequentes nos animais diagnosticados com múltiplos nódulos, independente da classificação histológica empregada. Também foi observada a associação entre a presença de nódulos múltiplos com estadio II ou IV (p<0,001) e com a presença de recidiva (p=0,001). Em relação à classificação histológica de Kiupel et al. (2011) foi possível observar associação estatística entre o grau histológico e o tamanho do tumor (p=0,001), a consistência (p=0,028) e a velocidade de crescimento do nódulo (p<0,001); aumento de linfonodo (p<0,001) e o tratamento empregado (p=0,002). Nódulos com tamanho superior a três centímetros (56,8%, n=21) e de crescimento rápido (52,9%, n=36%), eram mais frequentes nos tumores de alto grau. Aumento de linfonodo (80,6%, n=25) e tratamento quimioterápico (83,3%, n=5) também estavam associados a pacientes com alto grau histológico. Em relação à classificação de Patnaik et al. (1984), as variáveis raça e sexo diferiram proporcionalmente entre os grupos histológicos (p=0,008 e 0,040 respectivamente), sendo que o aumento do linfonodo e o crescimento rápido do tumor também tiveram associação com o grau histológico (p=0,002 e 0,001). Quase a metade dos pacientes (47,4%) foi submetidas ao tratamento cirúrgico e quimioterápico (n=91), sendo que em 31,3% (n=60) dos pacientes realizou-se apenas o procedimento cirúrgico. Sessenta e um animais (31,8%) apresentaram aumento de tamanho em linfonodos regionais (31,8%), sendo que 71,9% dos nódulos avaliados tiveram crescimento rápido. O tempo de evolução clínica do tumor foi menor ou igual a um ano, em 158 pacientes (82,3%), seguido por 25 pacientes (13%) com evolução de 1 a 2 anos. Foram observados 66 casos (40,5%) de recidiva e 16 (8,3%) de metástase à distância. Com este estudo, pode-se concluir que cães sem raça definida são os mais acometidos pelo mastocitoma cutâneo, na região de Jaboticabal, seguido por cães da raça Boxer, com idade variando entre 7 e 11 anos, não sendo observada predileção sexual; os nódulos encontrados eram predominantemente não ulcerados, solitários e menores que três centímetros; a maioria dos pacientes apresentou mastocitoma grau II, segundo Patnaik et al. (1984) e baixo grau segundo Kiupel et al. (2011); não se observou recidiva, em sua maioria, nem metástase em linfonodos e/ou a distância; o diagnóstico mais utilizado foi a punção aspirativa por agulha fina associada à histopatologia; a localização dos nódulos era mais prevalente nos membros pélvicos e torácicos, seguido por cabeça e pescoço. A consistência dos nódulos era de apresentação firme ou macia; e a metade dos pacientes foi submetida ao procedimento cirúrgico associado à quimioterapia antineoplásica.(AU)

This study analyzed the cases of cutaneous mastocytomas in dogs seen at the Governador Laudo Natel Veterinary Hospital of the College of Agrarian and Veterinary Sciences (FCAV), Unesp, in Jaboticabal, from 2005 to 2015. The objective was to determine the occurrence of this neoplasm regarding breed, sex, and age, the most affected body parts and observed neoplastic characteristics; the most widely used diagnosis methods, the main histological grades and recommended treatments, to evaluate size changes in relation to lymph nodes, recurrence rate, metastasis and to verify possible associations between the evaluated variables. The clinical files of 192 patients were evaluated. The most affected dogs were of mixed breed (n=46, 23.96%), followed by Boxer (n=40, 20.83%) and Pitbull (n=27, 14.06%). Most of the dogs were females (n=107, 55.7%), aged between 7 and 11 years old (n=120, 62.5%). Thirty-two patients had (16.7%) tumors located in the pelvic limb, followed by thoracic limbs (10.4% n=20). Sixty-five animals had ulcerated nodules (33.9%), of which 96 had firm consistency (50%). Seventy-six animals had multiple nodules (39.6%), and 39.1% of the sample (n=75) had nodules larger than three centimeters. The most used diagnosis method was fine needle aspiration together with histopathology (HT), totaling 39.8% of nodules (n=66), followed by HT in 37.3% of the patients (n=62). Regarding the histological variables, 18 patients had grade I (11.8%), 112 grade II (73.7%), and 22 grade III (14.5%) classified according to Patnaik et al. (1984). According to the classification of Kiupel et al. (2011) 37 cases were classified as high grade (35.2%) and 68 as low grade (64.8%). Statistical association was observed when the presence of solitary/multiple nodules and the histological grade were evaluated according to Patnaik et al. (1984) (P=0.008) and Kiupel et al. (2011) (P=0.004). The nodules with worse prognostic feature were more frequent in animals diagnosed with multiple nodules, regardless of the histological classification used. The presence of multiple nodules in stage II or IV (p<0.001) and recurrence of the disease (p=0.001) was also observed. Regarding the histological classification of Kiupel et al. (2011), there was a statistical association between histological grade and tumor size (p=0.001), consistency (p=0.028) and nodule growth rate (p<0.001), lymph node enlargement (p<0.001) and the treatment used (p=0.002). Nodules larger than three centimeters (56.8% n=21) and fast growing (52.9% n=36%) were more frequent in high-grade tumors. Lymph node enlargement (80.6% n=25) and chemotherapeutic treatment (83.3% n=5) were also associated with patients with this histological grade. According to the classification of Patnaik et al. (1984), breed and sex differed proportionally between the histological groups (p=0.008 and 0.040 respectively), and lymph node enlargement and rapid tumor growth were also associated with histological grade (p=0.002 and 0.001). Almost half of the patients (47.4%) underwent surgical and chemotherapeutic treatment (n=91) while only surgical procedure was performed in 31.3% (n=60) of the patients. Sixty-one animals (31.8%) had enlarged regional lymph nodes (31.8%), and 71.9% of the nodes evaluated had rapid growth. The clinical evolution time of the tumor was less than or equal to one year in 158 patients (82.3%), followed by 1 to 2 years in 25 patients (13%). There were 66 cases (40.5%) of recurrence and 16 (8.3%) of distant metastasis. With this study, it can be concluded that dogs with mixed breed are the most affected by cutaneous mastocytoma in Jaboticabal city, followed by Boxer dogs, with ages varying between 7 and 11 years, with no sexual predisposition observed. It was also concluded that nodules were predominantly non-ulcerated, solitary and smaller than 3 centimeters, that the majority of patients presented grade II mastocytoma according to Patnaik et al. (1984) and low grade according to Kiupel et al. (2011), not being observed in most of them recurrence, lymph node or distance metastasis. The most commonly used diagnosis was fine-needle aspiration associated with histopathology, and in relation to location, nodules were found predominantly in pelvic and thoracic limbs, followed by head and neck. The consistency of the nodules was both firm and soft, and half of the patients underwent the associated surgical procedure of antineoplastic chemotherapy.(AU)

Histochemical and immunohistochemical evaluation of angiogenesis in rabbits (Oryctolagus cuniculus) submitted to skin grafts associated with platelet-rich plasma / Histoquímica e imunohistoquíca na avaliação da angiogênese em coelhos submetidos ao emprego de enxertos cutâneos associado com plasma rico em plaquetas

Histochemical staining consists of a set of specific chemical reactions of structures or tissue-endogenous substances. Immunohistochemistry allows verification of proteins in tissues related to biological and pathological factors. The standardization of methods to assess angiogenesis resulting from formation of new blood vessels in procedures with stimulants is important to facilitate the implementation of research as well as to assist interpretation of data. In rabbits some markers of angiogenesis antibodies in the skin are not standardized because of cross-reactions that may occur because the antibodies are made from such animals.The aim of this study was to analyze the immunohistochemical methods through dyes and immunohistochemical markers angiogenesis in rabbits (Oryctolagus cuniculus) having undergone reconstructive surgery with skin grafts associated with plasma angiogenesis stimulator rich in platelets, in order to evaluate which method would be better to visualize the vessels, as well as to evaluate which antibody would promote better immunostaining, and find the differences between the methods and to standardize the methodology to be applied in experiments using rabbits. Sixteen rabbits were used, split into two groups of eight animals: Gprp (plasma rich in platelets) and Gc (control, saline solution, 9%). The same technique of reconstructive surgery using graft mesh was performed on each rabbit. The groups differed only in the application of platelet-rich plasma before the surgical wound synthesis. Samples for evaluation of angiogenesis were collected 15 days after the surgical procedure. The dyes Hematoxylin & Eosin and Masson's Trichrome were used in the histochemical study to evaluate vascular proliferation. Markers CD31, CD34 and Caveolin-1 was used for the immunohistochemical study. The evaluation between the groups (Gprp and Gc) in regard to the categorical variable (vascular proliferation intensity) used the Kruskal-Wallis test with p values equal to or less than 0.05 being considered significant. The immunohistochemistry was subjected to analysis of variance for a completely randomized design, with two groups and five repetitions (medium) and 5% significance level. Multiple comparison of groups resulted in the Tukey test (p=0.05) used. The amount of vascular proliferation assessed by histochemical method HE and Masson's Trichrome was found to be a significant variable in Gprp when compared with group Gc. When evaluating the methods used, there was no significant difference. There was no difference in the three markers which were used for correlating microvessels; however, there was more intense staining of vessels when Caveolin-1 Antibody was used. This caused intense marking of the capillaries and small vessels, as well as of larger vessels. When using CD31 and CD34, the same was observed, but it was not as intense as with Caveolin-1; though some cases showed sincere and discreet marking. The results of this study demonstrated that the histochemical methods performed are effective for semi-quantitative assessment of angiogenesis. The immunohistochemical comparison of Caveolin-1, CD31, and CD34 as markers of angiogenesis in rabbits showed that both antibodies could immunostain the newly formed vessels; but the Caveolin-1 showed better immunostaining in small and medium-sized vessels, as well as a minor presence in the background. Although not specific markers for angiogenesis, they can be used as immunohistochemical markers of vascular endothelium in rabbits.(AU)

Colorações histoquímicas consistem de um conjunto de reações químicas específicas das estruturas ou substâncias endógenas do tecido. Logo a Imunohistoquímica permite observar proteínas presentes nos tecidos relacionadas com fatores determinantes do comportamento biológico e patológico. A padronização dos métodos que avaliam a angiogênese decorrente de procedimentos que utilizam substâncias estimulantes à formação de novos vasos são importantes, a fim de facilitar a execução das pesquisas, bem como auxiliar na interpretação dos dados, visto que em coelhos alguns anticorpos marcadores de angiogênese na pele ainda não são padronizadas em virtude das reações cruzadas que podem ocorrer devido aos anticorpos serem confeccionados a partir de tais animais. Objetivou-se analisar os métodos histoquímicos por meio das colorações e imunohistoquímicas com marcadores de angiogênese em coelhos (Oryctolagus cuniculus) submetidos ao emprego de enxertos cutâneos associado com estimulador de angiogênese plasma rico em plaquetas, a fim de avaliar qual método seria melhor para visualização dos vasos, bem como avaliar qual anticorpo promoveria melhor imunomarcação, buscando-se assim encontrar a diferenças entre os métodos e padronizar a metodologia a ser aplicada em experimentos que utilizem coelhos. Utilizou-se 16 coelhos, separados em dois grupos com oito animais, compreendendo os grupos Gprp (plasma rico em plaquetas) e Gc (controle, solução fisiológica 0,9%). Em todos os animais foi realizada a mesma técnica de cirurgia reconstrutiva de enxertia do tipo malha, os grupos diferiram apenas a aplicação do plasma rico em plaquetas antes da síntese da ferida cirúrgica. As amostras para avaliação da angiogênese foram coletadas após 15 dias do procedimento cirúrgico. Utilizou-se no estudo histoquímico as colorações Hematoxilina & Eosina e Tricrômico de Masson para avaliação da proliferação vascular, e os anticorpos CD31 e CD34 e Caveolina - 1 para avaliação imunohistoquímica. A comparação entre os grupos (Gprp e Gc) em relação à variável categórica (intensidade de proliferação vascular) foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, com valores de p iguais ou inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Os dados imuno-histoquímico foram submetidos à análise de variância para um delineamento inteiramente ao acaso, com 2 grupos e 5 repetições (médias) e nível de significância de 5%. Nas comparações múltiplas das médias dos grupos, utilizou-se o teste de Tukey (α = 0,05). A intensidade de proliferação vascular avaliada pelo método histoquímico HE e Tricômico de Masson encontrou-se que tal variável foi significativa no Gprp, quando comparado com o Gc. Avaliando os métodos utilizados não houve diferença significativa. A contagem microvascular (MVC) realizada com os diferentes marcadores (Caveolina-1, CD31 e CD34) foi significativa no Gprp. Correlacionando a contagem microvascular dos três marcadores utilizados não houve diferença significativa, no entanto observou-se marcação mais intensa dos vasos utilizando o anticorpo Caveolina-1, sendo intensa a marcação dos capilares, vasos de pequeno calibre, bem como em vasos maiores. Nas avaliações de CD31 e CD34 observou que houve imunomarcação dos vasos, porém não foi intensa como a Caveolina-1, alguns casos apresentaram fundo, bem como marcação discreta. Os resultados encontrados neste estudo evidenciaram os métodos histoquímicos são eficazes para avaliação semiquantitativa da angiogênese. A comparação imunohistoquímicas da Caveolina-1, CD31 e CD34 como marcadores de angiogênese em coelhos evidenciaram que ambos os anticorpos são capazes de imunomarcar os vasos neoformados, porém a Caveolina-1 apresentou melhor imunomarcação de vasos de pequeno e médio calibre, bem como menor presença de fundo, embora não seja um marcador específico para angiogênese pode ser utilizada como marcador imunohistoquímico de endotélio vascular em coelhos.(AU)

Comparação de duas classificações histopatológicas com o padrão de imuno-marcação para KIT, a avaliação da proliferação celular e com a presença de mutações no c-KIT de mastocitomas cutâneos caninos / Comparison of two histopathological classifications with pattern of immunostaining KIT, evaluation of cell proliferation and the presence of mutations in c-KIT canine cutaneous mast cell tumors

A graduação histopatológica é o método de eleição para prever o comportamento biológico do mastocitoma e, atualmente, são utilizados os métodos de Patnaik e de Kiupel para dividi-los em graus de malignidade. O objetivo do presente trabalho foi comparar as duas classificações histológicas com as variáveis clínicas, os marcadores imuno-histoquímicos e com a presença de mutações para verificar as características que estão mais relacionadas entre si e com os piores prognósticos. Foram avaliados 61 animais, levando em consideração o sexo, a raça, a idade, a localização tumoral, o grau tumoral pelas classificações de Patnaik e Kiupel, a infiltração de eosinófilos, a marcação do KIT e do Ki-67 e a presença de mutação. As variáveis foram correlacionadas utilizando os testes de qui-quadrado, teste de Fisher, teste de verossimilhança e o teste de risco relativo. Os animais idosos foram os mais acometidos, enquanto os animais sem raça definida e os das raças Boxer, Labrador e Pinscher foram aqueles com maior predisposição ao desenvolvimento tumoral. A localização e a idade estão associadas ao grau tumoral. Os tumores em cabeça, pescoço e região genital têm 10 vezes mais chance de serem classificados como de alto grau (RR=10,667; IC95% 1,909-59,615, p=0,004) e os idosos oito vezes mais chance (RR=8,00; IC95% 0,955-67,009; p=0,029). Os tumores de grau II e os de baixo grau foram os mais encontrados e as duas classificações histológicas demonstram correlação muito significativa entre si (p<0,001). A concentração do infiltrado eosinofílico não demonstrou correlação significativa com nenhuma das classificações histológicas. O padrão KIT foi dependente da localização tumoral (p=0,015), já que os tumores genitais, na cabeça e no pescoço possuíam 18 vezes mais chance de apresentarem padrão citoplasmático (RR=18,571; IC95% 1,954-176,490; p=0,003), e das classificações de Patnaik (p=0,001) e Kiupel (p<0,001), sendo que os tumores de alto grau têm 36 vezes mais chance de apresentarem padrão citoplasmático (RR=36,00, IC95% 4,35-297,948; p<0,001). A marcação do Ki-67 demonstrou dependência da localização (p=0,024). A presença de mutação no exon 11 do domínio justamembrana não demonstrou associação com nenhuma das variáveis clínicas, das classificações histológicas, da concentração de eosinófilos e do padrão KIT. A presença da mutação foi correlacionada significativamente apenas ao Ki-67 (p=0,010). Os resultados obtidos sugerem que a localização é a variável clínica mais relacionada ao prognóstico e que apenas a classificação de Kiupel associada à imuno-histoquímica são eficientes para avaliar o comportamento tumoral.(AU)

Histopathological classification is the method of choice to predict the biological behavior of mast cell tumor. Currently, the methods of Patnaik and Kiupel are used to divide them into degrees of malignancy. The objective of this study was to compare the two histological grades with clinical, immunohistochemical markers and the presence of mutations to evaluate the characteristics that are more related to each other and with the worst prognosis. Sixty-one dogs were evaluated, taking into account sex, race, age, tumor location, tumor grade by grades Patnaik and Kiupel, infiltration of eosinophils, pattern KIT, Ki-67 and the presence of mutation . The variables were correlated using the chi-square test, Fisher's exact test, verisimilitude test and relative risk test. The older dogas were the most affected, while animals mixed breed, Boxer breeds, Labrador and Pinscher were those with greater predisposition to tumor development. The tumor location and age are associated with tumor grade. The tumors in the head, neck and genital area are 10 times more likely to be classified as high-grade (RR=10,667; 95% CI 1.909 to 59.615, p=0.004) grau and old-aged eight times more likely (RR=8.00, 95% CI 0.955 to 67.009, p=0.029). The grade II tumors and the low degree were the most frequent and the two histological scores showed very significant correlation (p<0.001). The concentration of eosinophilic infiltration showed no significant correlation with any of the histological scores. The standard KIT was dependent on tumor location (p=0.015), genital tumors, head and neck had 18 times more likely to have cytoplasmic pattern (RR=18.571, 95% CI 1.954 to 176.490, p=0.003), and Patnaik (p=0.001) and Kiupel (p<0.001) ratings. The high grade tumors are 36 times more likely to have cytoplasmic pattern (RR 36.00, 95% CI 4.35-297.948 p<0.001). The marking of the Ki-67 showed a dependence on the location (p=0.024). The presence of mutation in exon 11 of the juxtamembrane domain showed no association with any of the clinical variables of the histological scores, the concentration of eosinophils and KIT standard. The presence of the mutation was significantly correlated only to the Ki-67 (p=0, 010). The results suggest that the location is the clinical variable most related to prognosis and that only Kiupel classification associated with immunohistochemistry are efficient to assess tumor behavior.(AU)